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【關(guān)鍵詞】研究；應(yīng)用；免疫學(xué)檢驗；進展
伴隨著科技的發(fā)展和醫(yī)學(xué)的進步，免疫學(xué)檢驗技術(shù)有了突飛猛進的發(fā)展。從單一的免疫診斷技術(shù)發(fā)展為微量化、多基因和單細胞技術(shù)。而一些繼發(fā)性和原發(fā)性免疫缺陷及惡性腫瘤的臨床診斷，往往要求更加精確的免疫學(xué)檢驗技術(shù)，還能對臨床治療的有效性進行定量評價。
1免疫學(xué)檢驗技術(shù)的研究進展
1.1熒光素標記抗體技術(shù)
1.1.1流式細胞免疫熒光分析技術(shù)這是一種新型的血清試驗方法，它是在免疫熒光基礎(chǔ)上建立起來的，對抗體利用熒光進行染色，并在此基礎(chǔ)上對所需信息進行獲取，進而研制而成的流式細胞儀。其特征是擁有電子計算機技術(shù)和激光技術(shù)，主要是用于分析DNA含量，可在同一試管中，對多種靶物質(zhì)的潛在特征進行檢測。目前這種技術(shù)盡管還沒有應(yīng)用于臨床上，但卻受到許多臨床檢驗學(xué)者的關(guān)注。
1.1.2間接免疫熒光技術(shù)主要是檢測呼吸道病原體抗體、抗平滑肌抗體和抗病原體，可使自動化程度和標準化檢測提高，并使手工操作的誤差降低。這是一種相對成熟的技術(shù)，可用于商品的開發(fā)。
1.2酶標記免疫檢驗技術(shù)
1.2.1酶聯(lián)免疫吸附試驗技術(shù)在檢測酶聯(lián)免疫技術(shù)上，從理論上分析，相應(yīng)的抗體或者是某一抗原純品都可以進行應(yīng)用，所以在該技術(shù)的檢測上，抗體系統(tǒng)或者是可融性抗體都可以采納。這種技術(shù)是以免疫過氧化物為基礎(chǔ)，有較強的特異性、較高的敏感性，便于觀察、操作簡單，已經(jīng)在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用，利于進行大規(guī)模的檢查。
1.2.2酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)這是一種分析技術(shù)，應(yīng)用于對B細胞分泌免疫球蛋白的測定，是進一步衍伸和發(fā)展了定量酶聯(lián)免疫吸附試驗技術(shù)。微孔內(nèi)進入待檢測樣本后進行培養(yǎng)，在特異性抗原的作用下，對B細胞或者是記憶型T細胞進行活化，產(chǎn)生了IG或者是CK，清洗細胞之后，將第二抗體加入，IG或CK與抗體結(jié)合之后，在將酶生物素加入，發(fā)生反應(yīng)，而形成大小不一的圓形著色斑點。此技術(shù)即可用于各類CK的T細胞的分泌，還可用于抗體B細胞的分泌，這種技術(shù)也是檢測T細胞功能的標準技術(shù)，其檢測靈敏度相當高。
1.3新型標記免疫檢驗技術(shù)
1.3.1核酸標記免疫檢驗技術(shù)其原理是轉(zhuǎn)錄翻譯或者是擴增核酸。在極短的時間內(nèi)，通過聚合酶鏈反應(yīng)，按照幾何數(shù)在擴增，最終達到數(shù)百萬倍，這就是擴增。而轉(zhuǎn)錄翻譯是通過抗體DNA發(fā)生抗原反應(yīng)后，測定轉(zhuǎn)錄翻譯成的酶。靈敏性強是這兩種檢測方法的共同特征，目前，此種方法仍舊用于研究階段。
1.3.2量子點標記免疫檢驗技術(shù)在傳統(tǒng)的標記免疫分析技術(shù)中，有較低的酶免疫分析靈敏度，同時有很大的污染存在于放射免疫分析中，而熒光免疫分析和發(fā)光免疫分析都有著較短的發(fā)光時間，很容易發(fā)生淬滅。而在20世紀70年代，科學(xué)家們就開始廣泛關(guān)注良好的光電性能，并開始初步應(yīng)用標記免疫分析，其效果也非常令人滿意。量子由于有很小的尺寸，在受到刺激時，會發(fā)生熒光，所以它實際上是起到了探針的作用。在早期診斷疾病、細胞成像、測定生物多組分和免疫示蹤定位時，其應(yīng)用價值非常廣泛。
2其他免疫檢驗技術(shù)
2.1微陣列免疫芯片技術(shù)這是一種小分子抗原分析平臺，具有高效的特征，是近年來剛剛出現(xiàn)的，它可以對復(fù)雜樣品中含量極低的目標物質(zhì)進行快速的定量檢測。同時，還可對生物樣品中全部蛋白質(zhì)含量的變化情況進行檢測。其優(yōu)點是能夠進行高通量的平行檢驗與分析，可使樣本或藥品的用量降低。
2.2液態(tài)芯片技術(shù)是新一代生物芯片技術(shù)，在20世紀70年代美國Luminex公司研制，其檢測平臺是流式細胞技術(shù)，其載體是帶編碼的微球體，可用于大規(guī)模的測定蛋白質(zhì)和核酸。還可用于檢測多種指標，包括傳染病、神經(jīng)―內(nèi)分泌等，可用于測試任何使用微量分析的系統(tǒng)。
3免疫學(xué)檢驗技術(shù)的發(fā)展趨勢
科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和醫(yī)學(xué)的進步，要求能夠準確分析從特定部位取得的微量樣本。隨著微納電子學(xué)及分子生物學(xué)的發(fā)展，在科研上免疫學(xué)檢驗技術(shù)也有了質(zhì)的飛躍，在此趨勢下，將不斷應(yīng)用各種更為敏感的新的分析方法，使免疫學(xué)檢驗技術(shù)朝著更新、更高的方向發(fā)展。
參考文獻
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關(guān)鍵詞：小兒哮喘；免疫學(xué)；發(fā)病機制
小兒哮喘是一種表現(xiàn)反復(fù)發(fā)作性咳嗽，喘鳴和呼吸困難，并伴有氣道高反應(yīng)性的可逆性、梗阻性呼吸道疾病，會嚴重危害兒童的身體健康，異常免疫反應(yīng)在發(fā)病中起著重要作用，其主要病理過程為氣道黏膜水腫，嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和中性粒細胞浸潤氣道，導(dǎo)致內(nèi)分泌物增多[1-2]。由于氣道有炎癥，使氣道高反應(yīng)性，細小支氣管管腔狹窄甚至閉塞，血清和氣道分泌物中總免疫球蛋白（IgE）和過敏原特異性IgE增高，該病理和病理生理改變的本質(zhì)是異常的免疫反應(yīng)。
1、遺傳學(xué)背景
哮喘為多基因遺傳病：其遺傳度高達77%，但環(huán)境因素僅占23%。通過結(jié)合DNA芯片技術(shù)與臨床表型關(guān)聯(lián)的分析得出：哮喘候選基因的篩選已被越來越多的人所關(guān)注。目前已發(fā)現(xiàn)11q與過敏體質(zhì)（atopy）有關(guān)，其控制總IgE和氣道高反應(yīng)性的基因位點位于染色體5q31成簇的細胞因子（IL-4，IL-13和IL-4受體）中。這些基因的突變導(dǎo)致細胞內(nèi)信息傳遞因子信息傳感和轉(zhuǎn)化活化劑-6（STAT6）活化[4]，促使atopy和哮喘的發(fā)生。而且β2受體的突變與哮喘有緊密的關(guān)系，位于14q的T細胞抗原受體（TCR）和特異性IgE反應(yīng)連鎖。由此可見，哮喘的發(fā)病和atopy的形成均具有遺傳背景.。然而近幾十年，哮喘的發(fā)病率卻在成倍的上升，這說明不僅僅是候選基因發(fā)生突變而導(dǎo)致的，主要原因是環(huán)境因素變化。此外，從已知的哮喘候選基因來看，均屬免疫因子的基因位點，這些基因多態(tài)性的表型（臨床表現(xiàn)）必然關(guān)系到免疫學(xué)改變[3]。
2、TH1/TH2 細胞功能失調(diào)
TH1 細胞的主要通過分泌IL-2和IFN- γ等細胞因子對抗細胞內(nèi)細菌及原蟲的免疫反應(yīng)，對誘發(fā)器官特異性自身免疫病、器官移植排斥反應(yīng)以及抗感染色疫中起面議調(diào)節(jié)作用，而TH2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，能夠在誘發(fā)過敏反應(yīng)中調(diào)節(jié)體液免疫反應(yīng)，并輔助B細胞合成轉(zhuǎn)化免疫球蛋白，其中，分泌出的IL-4能夠促進IgE的合成，IL-5和IL-8能夠延長嗜酸性粒細胞在氣道內(nèi)的存活時間，所以，形成過敏體質(zhì)的基礎(chǔ)便是TH2的功能亢進[4]。
在一般情況下，TH1/ TH2細胞處于恒定狀態(tài)，二者功能發(fā)生變化時又會產(chǎn)生相互影響，例如當哮喘患者TH1細胞功能下降時，TH2細胞的功能就反而增大，導(dǎo)致生成大量炎癥因子，IFN- γ水平降低，IL-4、IL-5水平升高，說明患者體內(nèi)TH1/ TH2功能失調(diào)，當然，TH1細胞和TH2細胞的功能并不是相互獨立的，TH1/ TH2細胞起著相互抑制的作用，當TH1內(nèi)的細胞因子IFN- γ拮抗TH2的IL-4和IL-10時，會導(dǎo)致TH2細胞的活性減弱，相反，當TH2細胞內(nèi)的細胞因子IL-4和IL-10拮抗IL-2和IFN- γ時，TH1細胞的活性就會減弱?？偯庖咔虻鞍讜龠M肥大細胞和嗜酸粒形細胞分化，進而形成以IgE為特征的速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，即遲發(fā)型哮喘反應(yīng)。
從最近的小兒哮喘發(fā)病機制的研究結(jié)果：諸多哮喘患兒的體內(nèi)并不存在TH1細胞功能低下或者TH2細胞功能亢進的現(xiàn)象，由此表明，TH1/ TH2細胞失衡并不是導(dǎo)致小兒哮喘發(fā)病的唯一因素，還尚有其他亟待可知的機制參與。
3、TH2細胞引起免疫反應(yīng)
1、嗜酸性粒細胞（eosinophil） 嗜酸性粒細胞屬于白細胞，其具有粗大的嗜酸性顆粒，內(nèi)含有過氧化物酶和酸性磷酸酶，氣道全層會在TH2細胞內(nèi)的細胞因子IL-5和 IL-13的誘導(dǎo)下聚集大量嗜酸性粒細胞，從而釋放出炎癥介質(zhì)，主要有嗜酸細胞神經(jīng)毒蛋白、膠原酶、NO、以及血小板激活因子等。
2、免疫球蛋白（IgE） IgE是人體的一種抗體，存在于血中，可以引起I型超敏反應(yīng)，TH2細胞內(nèi)的細胞因子IL-4能夠促成lgE的合成，它與肥大細胞和嗜堿性粒細胞結(jié)合釋放出炎性介質(zhì)，從而產(chǎn)生免疫功能。
3、細胞黏附分子（CAM） 細胞黏附分子能夠通過介導(dǎo)白細胞與內(nèi)皮細胞及其他氣道結(jié)構(gòu)細胞的相互作用來調(diào)控白細胞在局部的聚集與歸巢等活動[2]，由于TH2內(nèi)細胞因子IL-6以及腫瘤壞死因子的刺激，導(dǎo)致炎癥細胞大量在氣道聚集。同時，血管細胞黏附因子、細胞間黏附分子、分泌因子都會到氣道參與聚集。
4、趨化因子（chemokines） 趨化因子在炎癥反應(yīng)中有著不可替代的作用，它能夠吸引白細胞移行到感染部位的一些低分子量趨化因子（多為8-10KD），同樣，嗜酸細胞活化趨化因子也會參與到炎癥細胞在氣道聚集。
5、內(nèi)皮素（Ets） 內(nèi)皮素存在于血管內(nèi)皮以及各種組織和細胞中，是調(diào)節(jié)心血管功能的重要因子，能夠維持基礎(chǔ)血管張力與心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)。其合成主要取決于巨噬細胞原炎癥因子和腫瘤壞死因子-α的調(diào)控。內(nèi)皮素不僅能夠有效收縮支氣管平滑肌，而且還能促進黏膜下腺體的分泌以及促使平滑肌合成纖維細胞的增殖。
4、樹突狀細胞（DC）
樹突狀細胞是機體功能最強的專職抗原遞呈細胞，能高效地攝取、處理和遞呈抗原，自身有很強的免疫刺激能力，對小兒哮喘的發(fā)病機制起著至關(guān)重要的作用。其通常少量分布于與外部接觸的皮膚部位，DC主要分為髓樣DC（DCl）和淋巴樣DC（DC2），DCl分泌的IL-12和IL-18促使TH0細胞分化為TH1細胞，由于IL-4的刺激，TH0漸漸向TH2發(fā)育，同時IFN- γ的正反饋刺激DCl 使TH1分泌更多的IL-12，因而導(dǎo)致DCl功能不足，TH1/ TH2細胞功能失衡，很大程度上，會引起人的過敏反應(yīng)[5]。
DC有成熟狀態(tài)和未成熟狀態(tài)，在人體內(nèi)， DC大部分是非成熟狀態(tài)，未成熟DC有極強的抗原吞噬能力，在攝取抗原或受到外界因素刺激時就會分化為成熟DC，而成熟DC能有效激活初始型T細胞，近年來，人們越來越重視微環(huán)境因素對不成熟DC發(fā)育可能造成的影響，比如細胞因子。
最近研究表明又出現(xiàn)了低3種表型的DC[6]，即低分化DC，其吞噬功能很強，但分泌細胞因子的能力較弱，它與DC1、DC2不同的是，在提呈抗原的過程中并不會激活TH0細胞。由此看出，樹突狀細胞對小兒哮喘的發(fā)病具有關(guān)鍵作用。
5、免疫耐受現(xiàn)象
免疫耐受是指免疫活性細胞接觸抗原性物質(zhì)時所表現(xiàn)的一種特異性的無應(yīng)答狀態(tài)，如在抗原或過敏原刺激下，樹突狀細胞內(nèi)不成熟的DC能夠抑制氣道炎癥反應(yīng)。但準確機制尚不明，導(dǎo)致不成熟DC誘導(dǎo)T細胞的無能化，可能是由于它們之間缺少共刺激分子。
6、哮喘的發(fā)作與因素
哮喘發(fā)作的前兆便是出現(xiàn)過敏體質(zhì)，與TH2細胞不同，T細胞主要產(chǎn)生IL-10來抑制TH1細胞和TH2細胞，而TH3細胞主要分泌TGF-β來抑制炎癥的反應(yīng)，通過誘導(dǎo)共刺激分子，T細胞、TH3細胞由于與其配體的相互連接而被活化 ，從而導(dǎo)致細胞功能缺乏，免疫耐受狀態(tài)被破壞，便出現(xiàn)了過敏體質(zhì)。
由于近年來哮喘發(fā)病率急速上升[7]，隨之便出現(xiàn)了各種導(dǎo)致因素，感染便是其中之一，感染的抗哮喘機制是極其復(fù)雜的，通過toll樣受體細菌會促使TH1的發(fā)育，由于缺乏經(jīng)常性呼吸道感染的原因，導(dǎo)致TH1不能完全發(fā)育，使新生兒時期，TH2細胞的功能亢進發(fā)展迅速，便形成了過敏體質(zhì)。已有醫(yī)學(xué)證明鼻病毒、腺病毒、衣原體或支原體呼吸道感染也會導(dǎo)致哮喘的發(fā)作，但是也并不是所有的呼吸道感染都能誘發(fā)哮喘的發(fā)作。是否導(dǎo)致哮喘的發(fā)作取決于病原體的抗原成分，成分不同，可能誘發(fā)哮喘也可能抗哮喘，哮喘的發(fā)作與感染機會并沒有直接的關(guān)系。
7、哮喘的免疫學(xué)治療
隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷更新，目前已研究出許多控制哮喘發(fā)作的方法，如氣道吸入糖皮質(zhì)激素、抗原特異性免疫療法以及LgE單克隆抗體治療等療法，但這些并不能從根本上治療哮喘，，如糖皮質(zhì)激素，它只能控制哮喘癥狀，必須持續(xù)用藥來預(yù)防復(fù)發(fā)。所以深入研哮喘發(fā)病機制探索出一種新的能夠抑制哮喘的發(fā)作的療法是有意義的。
由于哮喘發(fā)作的機制是免疫耐受被打破，所以想要研究出預(yù)防和治療哮喘的有效方法就需重建免疫耐受，增強免疫耐受的方法如下：
7.1益生態(tài)學(xué)治療：為激活黏膜免疫系統(tǒng)NOD2的活性來預(yù)防過敏性疾病的發(fā)生，可口服乳酸桿菌。
7.2抗原特異性免疫治療：通過反復(fù)接觸少量過敏原來調(diào)節(jié)機體的免疫應(yīng)答，使機體產(chǎn)生耐受性，當機體再次接觸過敏原時，便可減少介質(zhì)釋放，減輕氣道炎癥，從而降低氣道反應(yīng)性。
7.3脫敏治療：脫敏治療有口服過敏原和皮下注射過敏原，為提高其特異性免疫耐受，可通過誘導(dǎo)IL-10來抑制IL-4的產(chǎn)生。皮下注射過敏原已廣泛應(yīng)用于小兒哮喘的臨床。
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關(guān)鍵詞：鴨坦布蘇病毒；病原學(xué)；天然免疫；獲得性免疫
中圖分類號：S858.32 文獻標識碼：B 文章編號：1007-273X（2016）10-0015-02
鴨坦布蘇病毒是一種近年來在我國發(fā)現(xiàn)的主要危害蛋鴨、種鴨的新發(fā)病毒，屬于黃病毒科黃病毒屬中蚊媒病毒恩塔亞病毒群的坦布蘇病毒。該病毒主要侵害鴨的生殖系統(tǒng)、導(dǎo)致種蛋鴨的采食量和產(chǎn)蛋量急劇下降[1]。鑒于該屬病毒大部分為蟲媒傳播病毒，常見的有登革熱病毒、日本腦炎病毒等，并且多為人畜共患病，因此對鴨坦布蘇病毒進行深入研究對公共安全衛(wèi)生有著重要的意義。
本文就近年來鴨坦布蘇病毒的病原學(xué)、天然免疫以及獲得性免疫研究等方面最新研究作一簡要概述，以期為該病的預(yù)防及控制提供參考。
1 病原學(xué)的研究
鴨坦布蘇病毒具有黃病毒典型的基因組特征：有囊膜糖蛋白，病毒顆粒呈球形，單股正鏈RNA病毒，有包膜顆粒，纖突在表面。病毒的基因組全長約為11 kb，只含有一個開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF），編碼一個長度為3 410個氨基酸的多聚蛋白，該多聚蛋白由3個結(jié)構(gòu)蛋白和7個非結(jié)構(gòu)蛋白組成，5′端非編碼區(qū)有I型m7GpppNp帽子結(jié)構(gòu)，3′端無poly（A）結(jié)構(gòu)[2，3]。鴨坦布蘇病毒基因組的編碼順序為依次為5′UTR、C、PrM、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5、3′UTR，其非編碼區(qū)在病毒的復(fù)制、翻譯、致病性等方面扮演著重要的角色[4]。
經(jīng)研究表明與免疫相關(guān)的蛋白主要是結(jié)構(gòu)蛋白E蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白NS1。E蛋白是病毒的包膜蛋白，含有病毒抗原決定簇，與宿主的免疫應(yīng)答作用密切相關(guān)，引起保護性免疫反應(yīng)，能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體[5，6]。在病毒致病過程中也起關(guān)鍵性作用，該蛋白上一些重要的氨基酸的替代即可引起神經(jīng)毒力和侵襲力的喪失。E基因還和病毒吸附、侵入宿主細胞有關(guān)[7，8]。非結(jié)構(gòu)蛋白NS1是黃病毒中最大的蛋白結(jié)構(gòu)，是病毒感染過程中所產(chǎn)生的主要免疫原，在病毒復(fù)制及病毒與細胞相互作用中起著重要的作用，是一種與膜功能相關(guān)的分泌型糖蛋白，表達于感染細胞的表面，參與病毒復(fù)制的早期階段[9]，有研究表明，主動免疫NS1蛋白（或者基因）和被動免疫NS1蛋白的特異性抗體，都能對接受致死劑量的黃病毒攻擊的實驗動物產(chǎn)生保護性免疫，而不產(chǎn)生抗體依賴性增強作用，因此它可作為亞單位疫苗研究的絕好材料[10-12]。
2 鴨坦布蘇病毒免疫學(xué)研究
先天性免疫（天然免疫）和獲得性免疫是機體防御病原微生物的兩大機制，機體的先天性免疫系統(tǒng)在抵抗病毒的感染中發(fā)揮著重要作用。當宿主受到病毒感染，其通過模式識別受體（PRRs）識別病原相關(guān)分子模式，激活宿主的先天性免疫反應(yīng)，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素，促炎癥細胞因子等一系列的抗病毒因子。先天性免疫在進化過程中產(chǎn)生了一套相應(yīng)的天然免疫識別分子，也稱模式識別受體[13]。根據(jù)模式識別受體功能和定位的不同，可將其大致分為體液中的游離受體、細胞表面吞噬受體、細胞膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體四類[14]。與鴨坦布蘇病毒相關(guān)的研究主要是細胞膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體和細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是最具有代表性的細胞膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的人類TLRs家族有11個成員[13]，該家族成員均屬于I型跨膜蛋白，具有胞外區(qū)、跨膜段和胞內(nèi)區(qū)，其中TLR2，TLR3，TLR4，TLR7，TLR8和TLR9能夠識別病毒。細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體存在于細胞質(zhì)中，通過識別胞質(zhì)內(nèi)的病原體及其產(chǎn)物來激活轉(zhuǎn)錄因子，從而產(chǎn)生相應(yīng)的抗病毒免疫反應(yīng)，其主要的成員有RIG-I樣受體、NOD樣受體以及DNA受體家族[15]。
2.1 鴨感染坦布蘇病毒的天然免疫應(yīng)答研究
近些年來，自鴨坦布蘇病毒暴發(fā)以來，很多科研單位開展了鴨天然免疫因子及信號通路的研究。Chen等[16]通過將禽源坦布蘇病毒毒株CJD05株接種雞源細胞CEF、人源細胞系293T以及SPF雛雞進行體內(nèi)體外試驗，研究表明坦布蘇病毒通過MDA5和TLR3依賴的信號通路激發(fā)宿主的天然免疫應(yīng)答；Fu等[17]通過免疫熒光定量PCR方法檢測了鴨感染坦布蘇病毒后，肝、脾、肺、腎、胸腺、法氏囊、卵巢等七個組織中與天然免疫應(yīng)答相關(guān)的四個因子的表達情況，結(jié)果表明，雌麻鴨在坦布蘇病毒感染后24 h，受體RIG-I和MDA5轉(zhuǎn)錄因子的表達量達到最高峰值，兩個干擾素INF-α和INF-γ的表達水平也呈上調(diào)趨勢，但在病毒感染的時間相關(guān)性上，表現(xiàn)得與受體RIG-I和MDA5上調(diào)表達不同；相對而言，Li等[18]也利用熒光定量PCR方法，更為全面的研究了鴨感染坦布蘇病毒后的免疫應(yīng)答和病毒在宿主體內(nèi)的分布情況， 研究結(jié)果表明，鴨坦布蘇病毒在感染早期復(fù)制很快，在感染1 d后脾臟中的含毒量最高，跟宿主天然免疫相關(guān)的受體Rig-I、Mda5和TLR3，促炎因子IL-1β、IL-2、IL-6、Cxcl8，以及抗病毒蛋白Mx、Oas等在坦布蘇病毒感染的早期均上調(diào)表達；另外對與宿主特異性免疫相關(guān)的MHC-I和MHC-II也進行了檢測，MHC-I在腦和脾臟中均上調(diào)表達，MHC-II則不同，僅在腦中上調(diào)表達，在脾臟中下調(diào)表達；同時干擾素INF-α、INF-β、INF-γ在脾臟中也有不同程度的上調(diào)表達，但是在腦中的表達則存在著差異；研究表明，鴨坦布蘇病毒在感染的早期在各組織臟器中快速復(fù)制，激活了宿主的天然免疫，但是過表達的細胞因子同時也損害了宿主機體本身。
2.2 鴨坦布蘇病毒病的獲得性免疫研究
機體抗病毒感染免疫包括天然免疫和獲得性免疫，獲得性免疫即特異性免疫，包括體液免疫和細胞免疫。該病毒為新發(fā)病毒，獲得性免疫的分子機制還在起步階段，本文主要是指鴨坦布蘇病毒的疫苗研究進展，該病在2010年首次爆發(fā)流行時，由于商品化疫苗的缺乏，針對該病沒有有效的免疫預(yù)防措施，很多規(guī)?；B(yǎng)鴨場都使用自家滅活苗進行免疫防治，一定程度上緩解了該病的流行。近些年來對該病的基因工程疫苗方面取得了一定的進展，Zou等[19]以鴨瘟病毒為載體插入病毒主要表面抗原E蛋白，研制了一株抗鴨瘟病毒及鴨坦布蘇病毒重組疫苗。Chen等[20]報道了利用反向遺傳技術(shù)構(gòu)建了以鴨瘟病毒為載體表達鴨坦布蘇病毒截短分泌型E蛋白及PrM蛋白的重組二價弱毒疫苗候選株，此外，鴨坦布蘇病毒的組織苗研究取得了較大的進展，目前已有兩家單位成功申報了新獸藥證書，一個是中國農(nóng)科院上海獸醫(yī)研究所李澤君等[21]研究團隊將鴨坦布蘇病毒強毒株（FX2010株）在雞胚成纖維細胞上連續(xù)傳代培養(yǎng)180代，獲得致弱毒株并利用該致弱毒株制備的鴨坦布蘇病毒活疫苗，研究顯示該弱毒活疫苗可對鴨子提供較高的保護率；另一家是北京市農(nóng)林科學(xué)院劉月煥研發(fā)團隊，研制了鴨坦布蘇病毒滅活疫苗。鴨坦布蘇病毒活疫苗和滅活疫苗目前均已轉(zhuǎn)讓給公司進行開發(fā)上市。
3 討論
迄今為止，關(guān)于鴨坦布蘇病毒的發(fā)病機理和免疫應(yīng)答尚不明確，仍有很多問題需要進一步深入研究，天然免疫是機體抵抗病原微生物入侵的第一道防線，同時也是激活獲得性免疫的重要前提和基礎(chǔ)。很多生物如人、豬、鼠、原雞等天然免疫系統(tǒng)已經(jīng)研究的比較清楚，而對鴨的了解仍然知之甚少。目前隨著鴨的全基因組序列測序成功，鴨體內(nèi)的一些免疫因子也相繼被擴增和注釋。Li等[22]從鴨胚成纖維細胞中克隆得到的MAVS，該分子是線粒體抗病毒信號蛋白，作為信號分子參與宿主防御和促使機體產(chǎn)生I型干擾素IFN-I；Cheng等[23]從鴨脾臟中克隆并鑒定了MyD88的兩個異構(gòu)體，該分子是骨髓樣分化因子，在I型IL-1R和TLRT導(dǎo)NF-κB的激活信號通路中起著調(diào)節(jié)作用。這些研究結(jié)果對進一步研究鴨坦布蘇病毒感染后宿主體內(nèi)免疫反應(yīng)的分子機制提供了有力的技術(shù)支撐。
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關(guān)鍵詞：免疫蛋白組學(xué)；研究進展
中圖分類號：Q939.91文獻標識碼：A文章編號：1672-979X(2007)03-0050-05
Research Advance in Immunoproteomics
HAN Chen
(College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400716, China)
Abstract：Immunoproteomics is a new science from the combination of proteomics and immunological analytical methods. The forming process，tools, main technical points and applications of immunoproteomics have been discussed in this paper. Meanwhile, the development of this new science is prospected in terms of its limitations.
Key words：immunoproteomics; advance
免疫原性蛋白質(zhì)一直是微生物學(xué)家及醫(yī)學(xué)家研究的熱點。酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）、免疫共沉淀及蛋白質(zhì)印跡（Western blot）等技術(shù)都是基于抗原抗體特異結(jié)合的原理，用于檢測抗原存在與否，及探測一種疾病或一種微生物的免疫蛋白質(zhì)組。但是，ELISA不能區(qū)分不同的免疫原性蛋白質(zhì)，免疫沉淀則需要大量的抗體，且在抗原鑒定前需要去除抗體。起初，科學(xué)家曾試圖用抗體從電泳后的固體膠中探測抗原，但因所需抗體量大、操作過程復(fù)雜且重復(fù)性差等原因進展緩慢。蛋白質(zhì)從凝膠向膜轉(zhuǎn)移技術(shù)的建立，使經(jīng)凝膠分離后免疫原性蛋白質(zhì)的探測成為可能，也促進了蛋白質(zhì)印跡技術(shù)的發(fā)展。但傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)由于電泳分離的效果差，及抗原鑒定成功率低，往往只用于普通的檢測、分析，很少用于大規(guī)模探測免疫原性蛋白質(zhì)[1]。
蛋白質(zhì)組學(xué)的特點是采用高分辨率的蛋白質(zhì)分離手段，結(jié)合高效率的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)，研究蛋白質(zhì)的各種代謝和調(diào)控途徑[2]，使分離高分辨率及鑒定高成功率復(fù)雜蛋白質(zhì)成為可能?，F(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)與傳統(tǒng)免疫雜交方法相結(jié)合產(chǎn)生了一門新興的交叉學(xué)科免疫蛋白質(zhì)組學(xué)（immunoproteomics）[3]。
1 蛋白質(zhì)組學(xué)
1.1概述
蛋白質(zhì)組學(xué)屬蛋白質(zhì)化學(xué)的范疇，蛋白質(zhì)化學(xué)包括研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，通常涉及生物化學(xué)和酶學(xué)。蛋白質(zhì)組學(xué)重點研究組成一個大系統(tǒng)的多個不同蛋白質(zhì)的相互作用，它需對復(fù)雜混合物進行分析，不是通過測定完整序列進行鑒定，而是在數(shù)據(jù)庫匹配工具幫助下進行部分序列測定。它是系統(tǒng)生物學(xué)而不是結(jié)構(gòu)生物學(xué)；是鑒定系統(tǒng)的行為而不是鑒定任何單一組分的行為。
“蛋白質(zhì)組”是一種細胞、組織或完整的生物體所擁有的全套蛋白質(zhì)[4]。生命科學(xué)的研究工作主要有4個層次：基因組學(xué)（genomics），轉(zhuǎn)錄組學(xué)（transcriptomics），蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）和代謝組學(xué)（metabolomics）。人類基因組計劃（human genomic project）順利完成之后，后基因組時代（post genome era）來臨，從而蛋白質(zhì)組學(xué)成為科學(xué)家面臨的最大挑戰(zhàn)[5-7]。
蛋白質(zhì)組學(xué)研究也是對分析手段的挑戰(zhàn)。如何同時測定一個生物中大量或全部基因的表達似乎通過引入cDNA或寡核苷酸微陣已得以解決。用DNA微陣和相關(guān)方法分析基因表達依賴于兩個重要工具：聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和寡核苷酸與互補序列的雜交。但是沒有類似的工具用于蛋白質(zhì)分析。原因首先是沒有蛋白質(zhì)PCR等價物，目前不可能有多肽分子類似于核苷酸通過PCR復(fù)制的方式復(fù)制；其次，蛋白質(zhì)不能專一性與互補氨基酸序列雜交。
另一個蛋白質(zhì)組學(xué)的特有問題是細胞中每一個蛋白質(zhì)產(chǎn)物并不一定只有一種分子實體。這是由于蛋白質(zhì)翻譯后有修飾[8]。修飾的內(nèi)容隨蛋白質(zhì)的種類、細胞的調(diào)節(jié)機制和環(huán)境因子變化，許多蛋白質(zhì)以多種形式存在。對任何特定基因的多種蛋白質(zhì)產(chǎn)物進行檢測和區(qū)分的必要性使蛋白質(zhì)組學(xué)在分析方面更具挑戰(zhàn)性[9]。
1.2蛋白質(zhì)組學(xué)的工具
高通量、高靈敏度和規(guī)?；碾p向凝膠電泳-質(zhì)譜是目前最流行、最可靠的技術(shù)平臺[10]；酵母雙雜交技術(shù)已用于研究蛋白質(zhì)連鎖群和蛋白質(zhì)功能網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。生物信息學(xué)方法在蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域已得到有效的利用，其中突出的代表是Eisenberg等聯(lián)合采用系統(tǒng)發(fā)育分布圖（phylogenetic profiles）法、融合蛋白序列（rosetta stone）法和基因鄰居（gene neighbor）法，成功地建立了酵母沉默信息調(diào)節(jié)子（silencing information regulator，SIR）作用網(wǎng)絡(luò)和酵母朊病毒（prion）功能連鎖網(wǎng)絡(luò)。
除雙向凝膠電泳，其他的蛋白質(zhì)分離技術(shù)包括一維十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 （1D -SDS AGE）、高效液相色譜（HPLC）、毛細管電泳（CE）、等電聚焦（IEF）和親和層析。最有力的技術(shù)是將不同的蛋白質(zhì)和肽分離技術(shù)結(jié)合為多維技術(shù)，例如離子交換液相層析（LC）與反相高效液相色譜（RP-HPLC）的串聯(lián)是分離復(fù)雜肽混合物的有力工具[11]。
1.3蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用
1.3.1蛋白質(zhì)表達譜鑒定生物或細胞的特定狀態(tài)，如分化、發(fā)育狀態(tài)或疾病狀態(tài)下蛋白質(zhì)的表達以及物理、化學(xué)刺激下蛋白質(zhì)的表達。這種信息對于檢測藥物治療的潛在靶子極為有用。
1.3.2蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)譜這是在生物系統(tǒng)中測定蛋白質(zhì)之間相互作用的蛋白質(zhì)組學(xué)方法。大多數(shù)蛋白質(zhì)在執(zhí)行功能時與其他蛋白質(zhì)密切相關(guān)，這些相互作用是通過體外純化的蛋白質(zhì)和酵母雙雜交系統(tǒng)獲得的。通過親和俘獲配對技術(shù)與分析蛋白質(zhì)組學(xué)方法相結(jié)合，蛋白質(zhì)組學(xué)可以鑒定更復(fù)雜的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)。在細胞中多蛋白質(zhì)復(fù)合物與點到點的信號傳導(dǎo)途徑有關(guān)。在蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)譜可測定的過程中，所有參與者的狀態(tài)是蛋白質(zhì)組學(xué)最具遠大前景的應(yīng)用之一。
1.3.3蛋白質(zhì)修飾譜這是鑒定蛋白質(zhì)怎樣以及在何處得到了修飾。許多蛋白質(zhì)翻譯后的修飾控制著蛋白質(zhì)的靶向、結(jié)構(gòu)、功能和轉(zhuǎn)換。此外，許多環(huán)境化學(xué)因素、藥物和內(nèi)源化學(xué)因素可產(chǎn)生修飾蛋白質(zhì)的活性親電體。修飾蛋白質(zhì)可用抗體測定，但是一個特定修飾的精確序列位點往往是未知的。蛋白質(zhì)組學(xué)是研究翻譯后修飾的性質(zhì)和序列專一性最好的方法。此法的擴展允許在一個網(wǎng)絡(luò)中同時鑒定調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的修飾狀態(tài)，這是蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的重要擴充[12]。
2 免疫蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)要點
2.1二維凝膠電泳
二維凝膠電泳（two-dimensional gel elect-rophoresis，2DE）又稱雙向凝膠電泳，它的發(fā)展使得蛋白質(zhì)混合物的分離達到高重現(xiàn)性和高分辨率，使定性和定量分析2個或多個細胞或組織標本中的蛋白質(zhì)成為可能。2DE的出現(xiàn)早于通過基因測序技術(shù)檢測基因表達的方法，但2DE本身是一種重要的描述性技術(shù)，當分離后的蛋白質(zhì)缺少快速和可靠的鑒定工具時，它在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用受到限制。
軟電離技術(shù)電噴霧離子化 （ESI）和基體輔助激光解吸電離 （MALDI）的出現(xiàn)，使質(zhì)譜成為現(xiàn)代蛋白質(zhì)科學(xué)中最重要的組成部分?；w輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）、電噴霧離子化串聯(lián)質(zhì)譜（ESI-MS/MS）取代了速度較慢、靈敏度較差的Eadman化學(xué)降解法，用于分析和鑒定2DE分離所獲得的蛋白質(zhì)樣品。此類方法的一般步驟是：先從2DE膠切下待分析的蛋白質(zhì)斑點，用胰蛋白酶對蛋白質(zhì)進行膠內(nèi)消化，然后用質(zhì)譜技術(shù)分析消化后得到的多肽片斷，用MALDI-TOF-MS測定酶解后的多肽片斷得到肽質(zhì)量指紋圖譜并通過數(shù)據(jù)庫檢索來對蛋白質(zhì)進行鑒定。在同一實驗中未鑒定的蛋白質(zhì)，再用納升電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（nano- ESI-MS/MS）或聯(lián)機的反相毛細管柱液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜進行自動的數(shù)據(jù)掃描，肽離子經(jīng)碰撞誘導(dǎo)裂解（CID）產(chǎn)生的串聯(lián)質(zhì)譜圖譜，與數(shù)據(jù)庫中肽序列的理論串聯(lián)質(zhì)譜圖進行對比檢索，鑒定蛋白質(zhì)。
納升電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜是基于Wilm和Mann的理論研究，現(xiàn)已成為分析從1D和2D上分離得到的微量蛋白質(zhì)的有力工具。電噴霧上樣還可在電噴霧接口前用HPLC分離多肽（在線CapLC-ESI-MS/MS）。nano-ESI- MS/MS和在線CapLC-ESI-MS/MS 2種方法是相互補充的，各有優(yōu)勢[3]。
2.2 半干轉(zhuǎn)印
蛋白質(zhì)從凝膠中向固相支持物的轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了Western免疫雜交研究方法，由于是在液體環(huán)境中進行，它轉(zhuǎn)移速度慢，需要大電流，而大電流易產(chǎn)熱，所以實驗需在低溫下進行，使用很不方便。半干轉(zhuǎn)印解決了這個問題，且避免了緩沖液中不純雜質(zhì)向固相膜載體的轉(zhuǎn)移。半干轉(zhuǎn)印法只需將凝膠與膜緊貼，夾在轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡過的濾紙中間，然后將它們一起置于石墨電極之間，接通電源即可轉(zhuǎn)移，在室溫下1~2 h即可完成，非常方便。由于SDS在轉(zhuǎn)移環(huán)境中與蛋白質(zhì)可逆結(jié)合，如果膠上的蛋白質(zhì)與SDS已經(jīng)分離，則它由于失去了電場提供的驅(qū)動力而不能轉(zhuǎn)移到膜上；相反，如果蛋白質(zhì)已經(jīng)轉(zhuǎn)移到膜上而仍未與SDS分開，則蛋白質(zhì)可能穿透膜而不能結(jié)合到膜上，因此，要控制好半干轉(zhuǎn)印的時間。一般而言，高相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)易丟掉SDS而留在膠中，低相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)則不易丟掉SDS穿透膜。在陰極濾紙的轉(zhuǎn)印緩沖液中補加SDS可促進SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合，從而有利于高相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)向膜上轉(zhuǎn)移；通過增加雜交緩沖液中的離子強度，增加蛋白質(zhì)與膜之間的疏水性相互作用，使低相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)獲得了較好的雜交效率。
2.3免疫芯片
免疫芯片（immunochip）作為一種高通量同步多元檢測系統(tǒng)，其檢測操作所需樣品量少、反應(yīng)速度快、靈敏度高、穩(wěn)定性好，在分子診斷學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域?qū)笥凶鳛閇13]。
目前，蛋白質(zhì)組分析的研究主要依靠雙向電泳和質(zhì)譜，繁瑣且低效，亟需建立簡便易行、靈敏、高通量的表達蛋白質(zhì)分析方法。其中之一就是基于抗體微陣列的蛋白質(zhì)芯片[14]。通過抗體工程可以得到各種重組抗體，加上目前商業(yè)可得的抗體，將組成數(shù)量可觀的抗體庫，應(yīng)用這些抗體制造的抗體微陣列免疫芯片即能對含有各種功能基團的蛋白質(zhì)進行全面快速的分析。
隨著芯片微型化技術(shù)的發(fā)展，微點的尺度進一步縮小至納米尺度，出現(xiàn)了納米陣列（nanoarray）免疫芯片。納米點陣應(yīng)用原子力顯微鏡（atom force microscopy，AFM）的針尖制作，納點（nanospot）直徑一般為100~350 nm，僅約為微米陣列中微點尺度的1/1 000。它不僅微型化程度高，而且檢測程序無需進行分子標記，可直接用于復(fù)合物的測定，與表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）檢測方法有相似之處。2002年，美國西北大學(xué)的研究人員利用AFM制作了以免疫球蛋白為捕獲探針的納米陣列免疫芯片，并驗證其可與抗免疫球蛋白結(jié)合反應(yīng)。
探針點并非越小越好，當點尺度小到一定程度時，因每點所含捕獲分子數(shù)量過少，檢測體系將表現(xiàn)出較大的差異性，從而失去統(tǒng)計學(xué)意義[15]。
3 免疫蛋白質(zhì)組學(xué)的臨床應(yīng)用
3.1在糖尿病中的應(yīng)用
Ⅰ型糖尿?。═1DM）是一種多基因、多病因的自身免疫性疾病，發(fā)病特點是選擇性且不可逆的破壞胰島B細胞，導(dǎo)致胰島素產(chǎn)生障礙，患者終生需要外源性胰島素。1987年，Nepom等用2DE和免疫沉淀法分析T1MD患者HLA分子，發(fā)現(xiàn)HLA分子存在雜合性。Winer研究非肥胖型糖尿?。╪on obesity diabetes，NOD）小鼠和糖尿病患者，通過SELDI-TOF-MS的質(zhì)譜技術(shù)鑒定出胰島Schwann細胞和Langerhans細胞分泌自身抗體，刺激膠質(zhì)纖維酸性蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，T1DM發(fā)病機制中存在自發(fā)免疫系統(tǒng)對抗胰島神經(jīng)組織的途徑。Nielsen等的體外研究發(fā)現(xiàn)，B細胞成熟過程中在2 239個蛋白點中135個有差異變化，這是翻譯后修飾的結(jié)果，這些翻譯后修飾的蛋白質(zhì)是研究T1DM發(fā)病機制的潛在靶位[16]。
蛋白質(zhì)組學(xué)的研究技術(shù)在提高，將雙向電泳技術(shù)用于小鼠組織，通過增大2D膠、使用窄范圍的pH膠、細胞器分離可以獲得超過10 000個蛋白點，遠遠超過傳統(tǒng)方法獲得的1 900個蛋白點。用 IL-1β研究胰島B細胞系的蛋白質(zhì)組學(xué)得到得結(jié)論是T1DM發(fā)病是多因素、動態(tài)的，并非某個基因單獨作用的結(jié)果。
3.2在腫瘤診斷中的應(yīng)用
蛋白質(zhì)組學(xué)被用于鑒定癌癥診斷的標志物，檢測疾病進展和鑒定治療的靶位。它在發(fā)現(xiàn)癌癥的標志物方面具有重要價值，因為蛋白質(zhì)組反映了細胞內(nèi)在的遺傳程序和直接的環(huán)境影響。美國國立腫瘤研究所組織的早期疾病探測研究機構(gòu)多中心三期臨床試驗得出結(jié)論：通過血清及儀器標準化質(zhì)控，增強激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（SELDI-TOF-MS）是目前最有希望的檢測腫瘤早期的方法[17]。對乳腺癌和卵巢癌檢測的敏感性和特異性為93%和91%，較傳統(tǒng)的檢測標志物癌抗原提高很多[18]；對前列腺癌檢測的敏感性和特異性為83%和97%；國內(nèi)外學(xué)者還用SELDI技術(shù)對肺癌、肝癌、胃癌、腸癌、食道癌、鼻咽癌、喉癌、胰腺癌、膀胱癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤進行了檢驗和研究，也取得了很好的效果[19, 20]。
3.3在病原性疾病中的應(yīng)用
許多感染性疾病如乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、梅毒、鼠疫等的抗原尚依賴ELISA、放射免疫法、免疫熒光法等間接測定，用SELDI則可同時直接檢測這些疾病特異性抗原的相對分子質(zhì)量，并進行窗口期檢查，這是其他檢測手段無法做到的。
Jungblut等[21]通過免疫蛋白質(zhì)組學(xué)手段，利用感染早期和晚期患者的血清研究了嘎氏疏螺旋體的免疫原性蛋白，在驗證了傳統(tǒng)使用的2個靶標抗原的同時，又找到了2個新的靶抗原。并且在幽門螺桿菌的診斷中，分別用幽門螺桿菌感染不同階段及其他原因?qū)е碌奈秆谆颊叩难澹綔y了幽門螺桿菌不同菌株的免疫原性蛋白，對其感染特異的免疫原性靶標蛋白進行了深入系統(tǒng)的研究，為其診斷、預(yù)防和治療奠定了良好的基礎(chǔ)。
應(yīng)天翼等[22]提取福氏賀桿菌2a 2457T全菌蛋白進行不同pH梯度的雙向電泳，結(jié)合蛋白質(zhì)印跡技術(shù)尋找發(fā)生免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)。用MALDI-TOF-MS鑒定了19個免疫反應(yīng)蛋白點，對應(yīng)于10種蛋白質(zhì)，成功建立了福氏賀桿菌2a 2457T的免疫蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，為尋找保護性抗原打下了基礎(chǔ)。
Pitarch等[23]通過免疫蛋白質(zhì)組學(xué)手段從白假絲酵母中鑒定到了42個有免疫原性的持家酶。通過進一步的研究發(fā)現(xiàn)，在念珠菌病發(fā)病過程中，磷酸甘油酸激酶與乙醇脫氫酶抗體的產(chǎn)生與刺激人的免疫分化有關(guān)，并驗證了循環(huán)系統(tǒng)中白假絲酵母特異性抗體對念珠菌病發(fā)展的抑制作用。他們認為，高濃度的抗烯醇酶抗體的出現(xiàn)標志著患者處于恢復(fù)期，可作為病情發(fā)展的標記物。此研究為念珠菌病的早期檢測及臨床跟蹤提供了靶標，且可能被用作設(shè)計抗真菌藥物及疫苗的靶標。
3.4在其他疾病中的應(yīng)用
英國Rrian Austen研究小組檢測了老年性癡呆（AD）患者的組織和腦脊液，發(fā)現(xiàn)了一種β-淀粉樣蛋白多肽，并被公認為是人腦產(chǎn)生神經(jīng)退行性改變的標志物[24]。用SELDI進一步確定了抗原變異片段，為B型多肽的片段1~42，相對分子質(zhì)量為4 511，是引發(fā)疾病的關(guān)鍵標志物。
在心血管病的診斷中，Allard等用SELDI技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)載脂蛋白C-I（ApoC-I）和載脂蛋白C-Ⅲ（ApoC-Ⅲ）可區(qū)別缺血性和出血性腦卒中。用SELDI技術(shù)測定補體C3α鏈及纖維蛋白原的早期降解蛋白指紋，能更早地發(fā)現(xiàn)心肌梗死。
最近，Chen等提出免疫蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)該分為3部分，（1）通過免疫蛋白質(zhì)組學(xué)篩選外膜中具有免疫原性的蛋白質(zhì)；（2）通過免疫后攻毒的方法鑒定免疫原性蛋白的保護性；（3）通過其中和能力來確定候選疫苗。按照上述原則，該研究小組通過實驗從嗜水氣單孢菌的外膜蛋白中篩選出了保護性達71.4%的抗原。但研究者認為，如果只作為診斷靶標，后兩步不是必需的，而應(yīng)通過與其他菌株之間的交叉反應(yīng)來篩選。
4 展望
目前免疫蛋白質(zhì)組學(xué)已成功地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的許多領(lǐng)域，如病源性微生物、自身抗原、腫瘤抗原及蛋白質(zhì)修飾等的研究；也應(yīng)用于不同種類免疫反應(yīng)以及免疫反應(yīng)過程中不同階段特異性免疫蛋白質(zhì)的研究。其原理還用于蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究，如通過磷酸化抗體來探測被檢蛋白質(zhì)中磷酸化的情況等。在今后生命科學(xué)的相關(guān)研究中，免疫蛋白質(zhì)組學(xué)將應(yīng)用于更為廣泛的領(lǐng)域。
方法學(xué)上，二維凝膠電泳-質(zhì)譜仍是目前最流行和較可靠的技術(shù)，但其通量、靈敏度和規(guī)模化均有待進一步加強，一些學(xué)者開始重視研究以色譜/電泳-質(zhì)譜為主的技術(shù)。此外，酵母雙雜交技術(shù)雖已用于研究蛋白質(zhì)連鎖群和蛋白質(zhì)功能網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，但尚缺乏快速、高效的手段獲取復(fù)雜蛋白質(zhì)相互作用的多維信息。蛋白質(zhì)組的生物信息學(xué)研究雖已有成功的先例，但其應(yīng)用范圍與準確率仍需提高，所面臨的更大挑戰(zhàn)是如何綜合信息，準確分析蛋白質(zhì)的相互作用，界定相互作用連鎖群。
學(xué)術(shù)上，在基因組、轉(zhuǎn)錄組基礎(chǔ)上的蛋白質(zhì)組全譜研究，微生物已有成功的報道，但是在高等生物尤其是哺乳動物尚未見報道，人類組織或細胞的蛋白質(zhì)組全譜研究則基本未涉足。此外，人類基因組草圖雖已公布，但是，估計的3.5萬左右基因中一半以上屬理論推測，需要從蛋白質(zhì)組水平予以檢驗與確認，因此，開展人類組織或細胞的蛋白質(zhì)組表達譜的分析勢在必行。
受基因調(diào)控的細胞內(nèi)各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之間是相互交錯和彼此關(guān)聯(lián)的。雖然近年人們對轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以及相互關(guān)系的認識取得了進展，但是，針對任一生物體組織、細胞開展全方位的蛋白質(zhì)組相互作用網(wǎng)絡(luò)的分析鮮有報道。而此類相互作用網(wǎng)絡(luò)的揭示對于深刻認識重要生理、病理過程的機制是不可缺少的[25]。
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【關(guān)鍵詞】 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù);基本原理;分類;應(yīng)用
近10多年來,當代生物技術(shù)的研究和應(yīng)用取得高速發(fā)展的同時,也大大推動了化學(xué)發(fā)光免疫分析方法(CLIA))的更新?lián)Q代速度。化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CLIA)是建立在放射免疫分析技術(shù)(RIA)理論的基礎(chǔ)上,以標記發(fā)光劑為示蹤物信號建立起來的一種非放射標記免疫分析法,具有靈敏度高、線性范圍寬、儀器設(shè)備簡單、操作方便、分析速度快和容易實現(xiàn)自動化和不污染環(huán)境等優(yōu)點,特別是能在較短的時間內(nèi)得到實驗結(jié)果,因此深受檢驗醫(yī)學(xué)工作者和臨床醫(yī)師的好評。
1 化學(xué)發(fā)光免疫分析的原理
化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的基本原理,化學(xué)發(fā)光免疫分析含有免疫分析和化學(xué)發(fā)光分析兩個系統(tǒng)[1]。免疫分析系統(tǒng)是將化學(xué)發(fā)光物質(zhì)或酶作為標記物,直接標記在抗原或抗體上,經(jīng)過抗原與抗體反應(yīng)形成抗原-抗體免疫復(fù)合物?；瘜W(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)是在免疫反應(yīng)結(jié)束后,加入氧化劑或酶的發(fā)光底物,化學(xué)發(fā)光物質(zhì)經(jīng)氧化劑的氧化后,形成一個處于激發(fā)態(tài)的中間體,會發(fā)射光子釋放能量以回到穩(wěn)定的基態(tài),發(fā)光強度可以利用發(fā)光信號測量儀器進行檢測[2]。根據(jù)化學(xué)發(fā)光標記物與發(fā)光強度的關(guān)系,可利用標準曲線計算出被測物的含量。
2 化學(xué)發(fā)光免疫分析的分類
化學(xué)發(fā)光免疫分析根據(jù)應(yīng)用發(fā)光體系應(yīng)用于免疫分析中的方式不同可分為直接標記發(fā)光物質(zhì)的免疫分析,酶催化化學(xué)發(fā)光免疫分析,電化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECLIA)。直接標記發(fā)光物質(zhì)的免疫分析,目前常見的標記物主要為魯米諾類和吖啶酯類化學(xué)發(fā)光劑。
3 化學(xué)發(fā)光免疫分析的臨床應(yīng)用
CLIA已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)的各個領(lǐng)域,成為替代RIA的首選技術(shù)。Amersham公司針對AmerliteTM發(fā)光增強酶免疫分析系統(tǒng)研制出的試劑盒項目有甲狀腺功能檢測的促甲狀腺素、三碘甲腺原氨酸、甲狀腺素、甲狀腺素結(jié)合球蛋白、游離甲狀腺素,與性激素有關(guān)的有促黃體激素、促卵泡激素、人絨毛膜促性腺激素、甲胎蛋白、雌二醇、睪酮,以及其他方面的如癌胚抗原、鐵蛋白、地高辛等。Amersham公司雖然研制出這10余種試劑盒,但因操作不夠簡便,檢測項目僅限于蛋白質(zhì)類大分子化合物,未能廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)檢測。
美國Ciba Corning公司研制的ACS:180自動CLIA系統(tǒng)能非常精確測量閃光。經(jīng)過不斷的改進,實現(xiàn)了ACS:180CLIA系統(tǒng)的全自動化,推出全新產(chǎn)品"ADVIA系列"。現(xiàn)有檢測項目47項,更多的項目還在開發(fā)之中。主要有甲狀腺系統(tǒng)、性腺系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、腫瘤標記物、心血管系統(tǒng)、血藥濃度及其他一些檢測項目。
經(jīng)過改良后,金剛烷衍生物在堿性磷酸酶作用下可發(fā)出高強度的輝光,光信號可持續(xù)1～2 h。隨后國外生產(chǎn)廠家研制出以堿性磷酸酶為標記物的試劑盒,與之相匹配的有DPC的IMMULITE全自動CLIA系統(tǒng)和Beckman的ACCESS全自動微粒子CLIA系統(tǒng)。IMMULITE全自動CLIA系統(tǒng)可檢測項目有心臟病、甲狀腺功能、性腺激素、傳染病、藥物、血清學(xué)、血液病、成癮藥物、糖尿病、過敏檢測和腫瘤標志物。ACCESS全自動微粒子CLIA系統(tǒng)主要可檢測甲狀腺功能、血液系統(tǒng)、內(nèi)分泌激素、藥物、腫瘤因子、心血管系統(tǒng)和糖尿病等項目。
目前商品化的ECLIA分析系統(tǒng)只有Roche公司的ECLIA全自動分析系統(tǒng)。主要特點是本底信號極微,特異性更高,最小檢出值可達1 pmol以下,操作十分簡便快速,是CLIA優(yōu)點較為集中的完美分析技術(shù)。已提供試劑盒的項目有腫瘤標志物、甲狀腺功能、內(nèi)分泌、傳染病、心肌標志物和維生素類等項目。
王陽[3]運用了電化學(xué)免疫分析技術(shù),檢測了3種腫瘤標志物癌胚抗原(Carcinoem-bryonic Antigen,CEA)、細胞角蛋白l9片段(Cytokeratin 19fragments,CYFRA21,1)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuron-specific enolase,NSE)水平,對肺癌診斷有實際應(yīng)用價值。張忠英[4]等利用電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)檢測尿CK19片段,結(jié)果顯示尿CK19檢測對膀胱癌等泌尿系統(tǒng)腫瘤診斷和復(fù)發(fā)監(jiān)測具有敏感性高、無創(chuàng)傷性的優(yōu)點,優(yōu)于血清CK19和尿細胞學(xué)檢查。動態(tài)觀察尿CK19片段含量的變化可降低急性尿感患者的假陽性率。王利娜[5]等應(yīng)用ECLIA測定和酶免疫測定(EIA)檢測乙肝標志物。結(jié)果:應(yīng)用ECLIA方法檢測HBsAg精密度,最大批內(nèi)變異≤8.30%,最大日間變異≤15.33%,HBsAg靈敏度0.05 ng/ml,HBeAg靈敏度0.03NCU/ml。HBsAg檢測范圍0.01～7 000 COI。顯示ECLIA檢測HBsAg靈敏度高,重復(fù)性好,檢測范圍寬。檢測HBeAg靈敏度可能更高。李錦洲[6]等采用ECLIA法對卵巢癌、良性卵巢腫瘤及健康婦女血清CA125分別進行測定,ECLIA用于第二代CA125(CA125-Ⅱ)測定,使CA125測定更加敏感恒定,每日之間差異較小。黃琛,湯漢紅等[7]在ECLIA法檢測與蛋白質(zhì)芯片法多腫瘤標志物結(jié)果差異的研究中顯示:兩種方法有較好的相關(guān)性(P
化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)在醫(yī)學(xué)的臨床應(yīng)用已非常成熟,有取代放射免疫分析技術(shù)和酶聯(lián)免疫分析技術(shù)而成為診斷市場上的主流產(chǎn)品的趨勢。國外的化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測系統(tǒng)價格昂貴,普及有一定的困難;國內(nèi)的化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測系統(tǒng)雖然價格較國外產(chǎn)品便宜很多,但其檢測的靈敏度和可靠性,還有待進一提高。研究者在如何提高免疫診斷的敏感性和特異性、發(fā)展新的分析體系和檢測技術(shù)便攜化等方面仍需要不斷努力。
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【關(guān)鍵詞】 老年人;乙型肝炎;免疫學(xué)
乙型肝炎(HB)是一種世界范圍內(nèi)流行的傳染病。據(jù)估計，全球約20億人曾經(jīng)感染HB病毒(HBV)，慢性感染者約有3.5～4億人，每年有100萬人死于HBV所致的肝硬化、肝衰竭及原發(fā)性肝癌〔1〕。我國為HB高發(fā)國家，人群HBV感染率約為9.09%〔2〕，HB已成為嚴重的社會問題。HBV感染和機體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)，兒童期HBV感染，約90%發(fā)展成為慢性感染，而青少年及成年期感染，僅有10%發(fā)展成慢性感染。隨著年齡老化，手術(shù)及輸血的機會增多，以及老年人臟器特有的變化，導(dǎo)致老年人慢性HBV感染機會明顯增加。
1 HBV的特點
HBV屬于嗜肝DNA病毒，其完整的病毒顆粒成為Dane顆粒，直徑42 nm，由雙層外殼和一個核心組成。核心直徑為27 nm，內(nèi)含環(huán)狀雙股DNA，DNA聚合酶、核心蛋白〔3〕。外部為包膜蛋白，厚約7 nm，即表面抗原。其基因組由S區(qū)、C區(qū)、X區(qū)和P區(qū)組成。S區(qū)編碼前S1蛋白、前S2蛋白及乙肝病毒表面抗原(HBsAg)。前S蛋白有很強的免疫原性。在HBV的附著和侵入宿主肝細胞的機制中起著重要的作用。前S1和前S2蛋白可引出和調(diào)節(jié)宿主的體液和細胞免疫應(yīng)答，對于清除體液內(nèi)的病毒和阻止病毒感染健康的肝細胞提供重要的免疫防御機制。C區(qū)由前C基因和C基因組成，前C基因編碼的蛋白質(zhì)經(jīng)加工后分泌到細胞外形成乙肝病毒e抗原(HBeAg)，C基因編碼的蛋白質(zhì)為HBcAg。目前認為HBcAg是宿主Tc(細胞毒T細胞)作用的主要靶抗原。P區(qū)是最長的開放性讀碼框，編碼多種功能性蛋白，包括逆轉(zhuǎn)錄酶/DNA聚合酶、RNA酶等，參與HBV的復(fù)制。X基因編碼X蛋白，可激活多種調(diào)控基因，與原發(fā)性肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。
2 HBV感染的免疫學(xué)機制
一般認為HBV不直接損害肝細胞，而是通過宿主的免疫應(yīng)答和反應(yīng)引起肝細胞的損傷和破壞。宿主免疫反應(yīng)的不同，直接影響HBV感染所致的轉(zhuǎn)歸。HBV感染后，機體清除HBV的機制主要包括特異性體液和細胞免疫反應(yīng)，以及非特異性免疫反應(yīng)。
2.1 急性HB的免疫機制 HBV感染肝細胞后，病毒抗原被抗原提呈細胞(APC)的蛋白酶體裂解成小分子的寡肽，并與肝細胞內(nèi)人類白細胞抗原(HLAI)類分子結(jié)合成復(fù)合物，表達于細胞表面，成為T細胞表位。CTL通過表面的CD8+分子與HLAI類分子產(chǎn)生黏附，并由TCR識別上述寡肽表位，此類CTL即為HBV抗原特異性CTL(HBV antigens Specific cytotoxic lymphocytes，HBVsCTL)。HBV特異性的CTL通過分泌大量的γ干擾素(IFNγ)等細胞因子達到清除病毒的作用。在自限性急性乙型肝炎患者中，特異性CTL應(yīng)答作用強，可能與病毒被迅速清除而肝細胞損傷較輕有關(guān)，而在老年患者中，胸腺老齡退化，T細胞活性下降，其亞群分布發(fā)生改變，導(dǎo)致CTL活性和殺傷力明顯下降，導(dǎo)致肝炎慢性化〔4〕。
2.2 HBV感染慢性化的免疫機制
2.2.1 天然免疫 樹突狀細胞(dendritic cells， DCs)，是至今發(fā)現(xiàn)的功能最為強大的專職APC，是機體對異己抗原發(fā)生免疫應(yīng)答的首要環(huán)節(jié)〔5〕。根據(jù)其細胞表面的標志可分為髓樣樹突狀細胞(myeloid dendritic cell，mDC)和漿細胞樣樹突狀細胞(plasmacytoid dendritic cell，pDC)。pDC在宿主對病毒的防御機制中起到重要的作用，并具有大量分泌Ⅰ型干擾素的能力。DCs既是天然免疫的重要組成部分，可通過Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)識別病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP)而觸發(fā)，分泌IFN、白介素(IL)等細胞因子，促進DCs自身成熟的同時，對病原體進行原始殺傷〔6〕。同時，DCs也是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁。成熟的DC表面高表達HLADR，CD86(B71)，CD80(B72)等共刺激分子，可高效激活未致敏T淋巴細胞，發(fā)揮特異性細胞免疫〔7〕。因此，DC的功能狀態(tài)、表達的TLR對機體天然免疫以及獲得性免疫起到關(guān)鍵作用。大量研究表明，老年慢性乙型病毒性肝炎患者外周血DCs存在表型缺陷，成熟障礙，功能下調(diào)〔8〕，不能有效將外來抗原有效遞呈給T淋巴細胞，而致不能及時有效啟動特異性免疫，清除HBV，最終導(dǎo)致HBV感染持續(xù)化。
Toll受體為Ⅰ型跨膜糖蛋白，識別特異性高度保守分子，可以表達在胞膜及胞內(nèi)，已知人的TLR受體有11種。其中TLR 2、4、5表達在細胞表面，TLR3、7、8表達在內(nèi)涵體和溶酶體膜，TLR9表達在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，活化后進入內(nèi)涵體和溶酶體〔9〕。其中TLR 3、7、8、9參與了抗病毒的天然免疫反應(yīng)〔10，11〕它在天然免疫中通過對病源分子相關(guān)模式(PAMP)的識別發(fā)揮作用，通過刺激信號的級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致細胞因子的產(chǎn)生和協(xié)同刺激因子的表達，在天然免疫和獲得性免疫中起到了橋梁的作用。大量的研究顯示HBV和天然免疫系統(tǒng)之間存在相互的作用，HBV可干擾Toll樣受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制細胞因子IL10、IFNγ、TNFα的產(chǎn)生，HBV還可引起MD1效應(yīng)分子的表達上調(diào)，進而引起TLR 4的表達下調(diào)，間接抑制TLR為媒介的免疫機制〔12〕，從而引起感染的持續(xù)化。
2.2.2 獲得性免疫 HBV感染機體后，除了早期建立起來的非特異性免疫應(yīng)答外，還有特異性免疫應(yīng)答，而后者更為重要。特異性免疫應(yīng)答主要包括體液反應(yīng)和細胞反應(yīng)。體液免疫中的特異性抗體主要作用是中和循環(huán)內(nèi)的病毒并阻止病毒感染健康的肝細胞，老年人B 細胞的成熟過程明顯減慢，其成熟周期延長，B 細胞各亞型的活力不同程度地下降，其周轉(zhuǎn)率也呈不同程度的減退;B 細胞表面免疫球蛋白(Ig)濃度降低，產(chǎn)生抗體活力亦隨增齡而下降，免疫應(yīng)答亦降低〔13〕。細胞免疫反應(yīng)包括抗原特異的細胞毒懷淋巴細胞(TCL)，自然殺傷細胞(NK)，抗體依賴的細胞毒細胞(ADCC)和淋巴因子激活的K細胞(LAK)等，其中以CTL最為重要〔14，15〕。
HBV特異性細胞毒性淋巴細胞(CTL)，通過T細胞受體(TCR)識別APC(病毒感染的肝細胞，吞噬病毒抗原的樹突狀細胞等)表面的主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompatibility complex MHC)Ⅰ類分子結(jié)合活化，活化的主要通過以下兩個途徑發(fā)揮作用①溶胞途徑:機體針對HBV編碼產(chǎn)物所產(chǎn)生的特異性T淋巴細胞，借助其分泌的穿孔素、顆粒酶及其表面表達的Fas配體等使病毒感染的靶細胞凋亡。②非溶胞途徑:機體針對HBV編碼產(chǎn)物所產(chǎn)生的特異性T淋巴細胞通過分泌特定的細胞因子如IFNγ和TNFα來抑制HBV的復(fù)制繼而達到清除病毒的作用〔16〕。CD4+T淋巴細胞的主要作用是輔助B淋巴細胞產(chǎn)生抗體及誘導(dǎo)CTL活化，同時也能增強樹突狀細胞的活化CD8+效應(yīng)T細胞的過程，從而清除病毒〔17〕。老年人因胸腺萎縮等原因表現(xiàn)免疫功能低下，而胸腺是主要的免疫器官，是T淋巴細胞成熟分化的場所，在老年慢性乙肝患者中，雖然T細胞的總數(shù)沒有發(fā)生明顯的變化，但是其增殖力及活性隨著胸腺的退化而逐漸下降，亞群分布發(fā)生變化，CTL活性及殺傷力受損，引起感染慢性化〔18〕。
3 老年慢性乙型肝炎的特點
HBV感染后慢性化的機制，除了特異性免疫應(yīng)答因素外，尚有許多其他的因素，病毒因素包括病毒的基因型、突變等宿主因素包括宿主的年齡、性別、人白細胞抗原基因型和免疫應(yīng)答等方面。
3.1 免疫系統(tǒng)退化 60歲以上老年人胸腺組織已不易測到。因此，細胞免疫功能顯著受損，淋巴細胞功能受損，B 淋巴細胞功能也隨之下降，致使體液免疫功能發(fā)生改變。另外，老年人血清免疫球蛋白IgA及l(fā)gG值增加，IgA增高更顯著，而IgM濃度下降，多數(shù)老年人血清中有自身抗體。這也反映老年人免疫系統(tǒng)失調(diào)。
3.2 病毒的變異 隨著HBV感染時間的延長，自身的不斷復(fù)制，以及宿主的免疫壓力、外環(huán)境和藥物的作用下，病毒會形成變異，從而對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生新的影響。其中比較常見的是前C區(qū)1896位點的變異，前C基因變異可能影響到抗原的加工、提呈，變異的抗原與HLA形成的復(fù)合物發(fā)生構(gòu)型變化，從而使CD4+T細胞失去了對復(fù)制病毒的特異性的識別能力，同時也影響CTL對病毒的識別，致使T細胞免疫作用下降。Bertoletti等〔19〕研究發(fā)現(xiàn)野生型病毒前C基因表達的產(chǎn)物可引起HLAA2限制性CTL發(fā)生反應(yīng)，而突變株病毒無此作用，說明特異性CTL對變異病毒的抗原喪失了反應(yīng)能力，從而導(dǎo)致宿主免疫功能低下。Tur等〔20〕也發(fā)現(xiàn)HBeAg的缺失易導(dǎo)致宿主免疫功能紊亂。慢性乙型肝炎病毒感染者前C區(qū)位點突變，常伴有較高水平HBVDNA復(fù)制效率，存在更嚴重的免疫紊亂，HBeAg的表達是影響宿主外周血T細胞亞群變化的一個重要因素。
4 總 結(jié)
HBV感染機體后，首先由APCs等吞噬細胞捕獲異己抗原，啟動天然免疫屏障，發(fā)揮非特異性的免疫應(yīng)答，起到初步清除病原體的目的。繼之通過一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，把異己抗原信號呈遞給淋巴細胞，啟動適應(yīng)性免疫，活化的CTL通過兩條途徑清除病毒即胞溶途徑分泌穿孔素、顆粒酶等細胞毒分子直接殺傷病毒感染的靶細胞或者途徑介導(dǎo)靶細胞凋亡和非胞溶途徑分泌細胞因子抑制病毒復(fù)制。而老年人胸腺老齡化退化，各種免疫細胞的活性明顯下降，機體免疫功能低下，免疫應(yīng)答能力下降，其抗原提呈功能及細胞免疫功能明顯下降，導(dǎo)致病毒感染的肝細胞持續(xù)發(fā)生損害，清除病毒抗原的作用明顯減弱，成為疾病的慢性化的主要因素。除上述因素外，老年人肝臟重量減輕，肝細胞數(shù)及細胞器數(shù)明顯減少，也參與疾病慢性化的過程中。因此，對于老年HB的免疫學(xué)的研究，對其治療及預(yù)后有重要意義。
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免疫膠體金定性檢測法主要有斑點免疫金滲濾法(DIGFA)和膠體金免疫層析法(GICA)。二種方法都具有檢測快速、簡單、特異性強、靈敏度高、抗基質(zhì)干擾強等優(yōu)點,因此是一種適合基層現(xiàn)場篩查的快速檢測方法。
1.斑點免疫金滲濾法
免疫金滲濾技術(shù)在上世紀80年代中期從固相酶免疫檢定技術(shù)上發(fā)展出來的。斑點免疫金滲濾法作為一種初篩試驗手段，體現(xiàn)了較高的早期診斷價值，有著很好的實用前景。李春暉等人[2]認為在糞便隱血檢測中，膠體金滲濾法的靈敏度、抗干擾能力均優(yōu)于鄰甲苯胺法。李如林等[3]利用ELISA、流式微球載體技術(shù)(FMA)和膠體金滲濾三種不同方法進行血清梅毒抗體檢測，結(jié)果顯示ELISA、FMA和DIGFA的三種方法靈敏度分別為96.00%、100%和94.00%，三種方法的特異性均為100%，提示三種方法的檢測結(jié)果具有極強的一致性。
2.膠體金免疫層析法
上世紀90年代初，在免疫金滲濾技術(shù)的基礎(chǔ)上又建立了一種更為簡易快速的免疫層析檢測技術(shù)。Marot-Leblond等[4]采用GICA法進行陰道念珠菌檢測,結(jié)果敏感性為100%,特異性為82%,優(yōu)于傳統(tǒng)革蘭染色鏡檢和微生物培養(yǎng)。方春元等[5]用膠體金早早孕定性檢測試驗和化學(xué)發(fā)光免疫法進行比較：2.0IU以下與陰性的符合率為100%、2.0～1000.0IU與弱陽性的符合率為97.2%、1000.0IU以上與強陽性的符合率為97.5%，二者結(jié)果有著較好的一致性。王玉金等[6]建立了一種霍亂弧菌O139膠體金免疫層析快速檢測法，檢測霍亂弧菌O139群的最低檢出濃度為1×105CFU/ml；與細菌培養(yǎng)法對比檢測184份臨床標本，特異性和靈敏度均達100％。Brunt等采用GICA技術(shù)檢測大腸桿菌O157,檢測限為500個細菌[7]。梁秋光等[8]用GICA檢測含鼠疫陽性參考血清的鼠型動物溶血血清45份，結(jié)果全部陽性，而間接血凝微量法的對照結(jié)果則無法判斷，表明GICA法在應(yīng)對溶血血清方面有著很大的優(yōu)越性。孟芳等[9]對心臟疾病患者進行心肌三聯(lián)測試，其靈敏度肌紅蛋白為100%、肌酸肌酶同工酶為96.3%和肌鈣蛋白為85.2%；結(jié)果表明膠體金法心肌三聯(lián)檢測卡，對診斷急性心肌梗死具有較好的臨床診斷價值。
二、半定量、定量檢
測膠體金本身具有明顯的紅色或粉紅色，可用肉眼與光學(xué)傳感器判斷檢測線(T)的顏色深淺，進行半定量、定量分析。
1.半定量檢測法
早期就有人提出硝酸纖維素膜上的顯色面積與抗體濃度呈正相關(guān)[10]，從而建立了半定量測定方法；曹丹如等[11]建立一種伴有定量質(zhì)控點的斑點免疫金滲濾法，可半定量檢測人尿中的微量白蛋白。該立法與散射免疫濁度法的結(jié)果符合性良好，已經(jīng)達到了對尿微量白蛋白篩查試驗的臨床要求。
2.定量檢測法
隨著膠體金免疫定量檢測儀的出現(xiàn)，開創(chuàng)了一種新型的快速定量分析方法。定量分析方法的原理是基于硝酸纖維素膜上檢測線(T)的顏色深淺與待測物濃度呈現(xiàn)一定的比例關(guān)系[12]；利用光學(xué)傳感器對試劑條進行掃描，與事先制定的標準曲線對比，從而得出定量分析的結(jié)果。由于膠體金試紙條檢測線顯色是一個動態(tài)過程，試紙條的生產(chǎn)工藝、檢測時的工作環(huán)境以及待測樣本的差異性等因素都會影響到這一動態(tài)顯色的結(jié)果[13]。因此有人提出了一種檢測線(T)/質(zhì)控線(C)比值定量法。T/C比值法是依據(jù)硝酸纖維素膜上的T、C線顯色反應(yīng)的影響因素基本一致，通過T、C線吸光值的比值，在一定程度上可以消除時間、溫度和待測樣本等因素對試紙條顯色過程的影響[14]，是一種較為合理的定量檢測方法。謝士嘉等[15]建立的膠體金免疫層析定量方法，能準確地檢測樣品中的金黃色葡萄球菌腸毒素B，其檢出限為8ng/ml，線性范圍為8~1000ng/ml。聶聰?shù)萚16]所建立的基于T/C比值的膠體金免疫層析方法,對相思子毒素檢測的靈敏度已達到為30ng/ml，線性范圍30~600ng/ml，敏感性與ELISA法相近，已達到臨床檢測范圍。
三、膠體金技術(shù)的其他應(yīng)用
1.在免疫電鏡上的應(yīng)用
隨著膠體金技術(shù)的不斷發(fā)展，人們將其與電鏡技術(shù)相結(jié)合，逐步形成了膠體金免疫電鏡技術(shù)。它具有靈敏度高、特異性強、定位精確等優(yōu)點。吳淑燕等[17]建立膠體金標記血小板膜糖蛋白的免疫電鏡技術(shù)，結(jié)果表明利用膠體金技術(shù)可以顯著的提高樣品的檢出率，為開展血小板功能研究奠定基礎(chǔ)。
2.在納米磁與核酸適配體上的應(yīng)用
納米磁分離-膠體金與核酸適配體-膠體金為當前二種新型的膠體金技術(shù)。納米磁性微粒和核酸適配體作為特異性識別元件，能夠?qū)蟹肿訌某煞謴?fù)雜的生物體系中分離出來，起到樣品的濃縮作用，從而提高檢測的靈敏度和檢出率[18]。
3.在多項聯(lián)合檢測技術(shù)上的應(yīng)用
多項聯(lián)合檢測技術(shù)可以同時檢測多種成分，能節(jié)省大量的檢測時間和成本，具有很大的應(yīng)用價值，是未來的發(fā)展方向。吳堅美等[19]建立了一種新型膠體金免疫層析試紙條，可同時檢測巨細胞病毒、風疹病毒、弓形蟲和單純皰疹病毒的4種抗體；與ELISA法對比，其符合率為97.90%~100%。吳文曄等[20]建立了一種能同時檢測檢測黃曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A兩種真菌毒素的膠體金試紙條，二種毒素的靈敏度均可達到2.5μg/L，且二者之間互不干擾，重復(fù)性、穩(wěn)定性均良好。
四、結(jié)語
